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深度解读高分子结合物含量检测方法

更新时间:2022-01-13 15:52:30 浏览次数:118次
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  在材料化学研究中,经常会用到混合物的分离,特别是高分子结合物、低分子结合物及游离多糖的分离,从而计算高分子结合物的含量。今天程诚小编就给大家科普一种常用的分离方法——乙醇沉淀-分光光度法,以及高分子结合物含量的计算方法。
  本法系利用高分子结合物、低分子结合物及游离多糖在不同乙醇浓度下,沉淀分离,采用紫外-可见分光光度法测定磷含量,计算高分子结合物的含量。
  一、试剂
  (1)5mol/L氯化钠溶液精密称定氯化钠29.22g,加水溶解并稀释至100ml,室温保存。
  (2)1.5mol/L硫酸于1体积98%的硫酸中加入11体积的水,混匀。
  (3)2.5%钼酸铵称取钼酸铵2.65g,加水溶解并稀释至100ml。
  (4)10%抗坏血酸称取抗坏血酸l0g,加水溶解并稀释至100ml。
  (5)矿化试剂硫酸与70%高氯酸等体积混合制得。
  (6)产色试剂水、1.5mol/L硫酸、2.5%钼酸铵、10%抗坏血酸,按2:1:1:1体积比混合配制。
  (7)80μg/ml磷对照品贮备液精密称定经100℃干燥的磷酸氢二钠0.3665g或磷酸二氢钾0.3509g,加水500ml、5mol/L硫酸溶液10ml溶解,补加水至1000ml。临用时,将贮备液做20倍稀释,即为4μg/ml磷对照品工作液。
  (8)1.0mol/L氢氧化钠溶液称取4g氢氧化钠,加水溶解并稀释至100ml。
  二、供试品溶液的制备
  (1)分步沉淀原液用生理氯化钠溶液稀释至多糖含量20~28μg/ml或成品疫苗3ml,加入5mol/L氯化钠溶液0.75ml,混匀后加入无水乙醇15ml,于-20℃冰箱放置72~96小时,以每分钟8000转4℃离心90分钟,吸取上清液为供试品溶液2;于沉淀中加入50%乙醇溶液0.5ml,加玻璃珠,混合后室温放置1小时;再加入50%乙醇溶液1.5ml,混合后室温放置2小时,然后以每分钟8000转8℃离心1小时,吸取1.8ml上清液为供试品溶液3;沉淀再加入1.0mol/L氢氧化钠溶液0.5ml,混合后室温放置1小时,加水1.25ml,作为供试品溶液4。
  (2)取多糖含量20~28μg/ml的原液或成品疫苗1.0ml为供试品1。
  (3)供试品溶液的矿化分别量取1.0ml供试品1、1.5ml供试品溶液2、0.7ml供试品溶液3、0.5ml供试品溶液4各2份;分别加入矿化试剂0.15ml,置150℃干燥1小时,然后升温至180℃干燥30分钟,再升温至250℃干燥1小时。
  三、测定法
  (1)量取水1.95ml,加矿化试剂50μl后加2.0ml产色试剂,混匀后置37℃水浴2小时,在波长825mn处测定吸光度,作为空白对照。
  (2)于矿化好的供试品溶液中加水1.85ml,加产色试剂2.0ml,混匀后置37℃水浴2小时,在波长825nm处测定吸光度。
  (3)分别量取磷对照品工作液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.0ml于试管中,每管依次加水1.85ml、1.75ml、1.55ml、1.15ml、0.95ml;然后每管分别加入矿化试剂50μl后加2.0ml产色试剂,混匀后置37℃水浴2小时,在波长825nm处测定吸光度。
  四、结果计算
  以磷对照品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回归,求得直线回归方程。将供试品溶液的吸光度代入直线回归方程,求出磷含量。
  供试品磷含量(μg/ml)分别为:
  P1=(A1×3)/1.0
  P2=(A2×18.75)/1.5
  P3=(A3×2.0)/0.7
  P4=(A4×2.0)/0.5-(P3×10)/100
  试验有效性80%≤P1/(P2+P3+P4)≤120%
  供试品高分子结合物含量(%)=P4(P2+P3+P4)×100
  供试品游离多糖含量(%)=[1-P4/(P2+P3+P4)]×100
  式中P1、P2、P3、P4为供试品1,供试品溶液2,供试品溶液3,供试品溶液4的磷含量;A1、A2、A3、A4为供试品1,供试品2,供试品3,供试品4中取样矿化后的磷含量。
  程诚小编结语:在不同的乙醇浓度下,高分子结合物、低分子结合物及游离多糖会沉淀并分离,这也是本法的实验原理。因为实验样品的差异性,该方法的准确性和不确定度也是尚待验证的,实际操作中大家可以多方法比较,从而确认实验结果的可靠性。
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