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在材料化学研究中，经常会用到混合物的分离，特别是高分子结合物、低分子结合物及游离多糖的分离，从而计算高分子结合物的含量。今天程诚小编就给大家科普一种常用的分离方法——乙醇沉淀-分光光度法，以及高分子结合物含量的计算方法。
本法系利用高分子结合物、低分子结合物及游离多糖在不同乙醇浓度下，沉淀分离，采用紫外-可见分光光度法测定磷含量，计算高分子结合物的含量。
一、试剂
（1）5mol/L氯化钠溶液精密称定氯化钠29.22g，加水溶解并稀释至100ml，室温保存。
（2）1.5mol/L硫酸于1体积98%的硫酸中加入11体积的水，混匀。
（3）2.5%钼酸铵称取钼酸铵2.65g，加水溶解并稀释至100ml。
（4）10%抗坏血酸称取抗坏血酸l0g，加水溶解并稀释至100ml。
（5）矿化试剂硫酸与70%高氯酸等体积混合制得。
（6）产色试剂水、1.5mol/L硫酸、2.5%钼酸铵、10%抗坏血酸，按2：1：1：1体积比混合配制。
（7）80μg/ml磷对照品贮备液精密称定经100℃干燥的磷酸氢二钠0.3665g或磷酸二氢钾0.3509g，加水500ml、5mol/L硫酸溶液10ml溶解，补加水至1000ml。临用时，将贮备液做20倍稀释，即为4μg/ml磷对照品工作液。
（8）1.0mol/L氢氧化钠溶液称取4g氢氧化钠，加水溶解并稀释至100ml。
二、供试品溶液的制备
（1）分步沉淀原液用生理氯化钠溶液稀释至多糖含量20～28μg/ml或成品疫苗3ml，加入5mol/L氯化钠溶液0.75ml，混匀后加入无水乙醇15ml，于-20℃冰箱放置72～96小时，以每分钟8000转4℃离心90分钟，吸取上清液为供试品溶液2；于沉淀中加入50%乙醇溶液0.5ml，加玻璃珠，混合后室温放置1小时；再加入50%乙醇溶液1.5ml，混合后室温放置2小时，然后以每分钟8000转8℃离心1小时，吸取1.8ml上清液为供试品溶液3；沉淀再加入1.0mol/L氢氧化钠溶液0.5ml，混合后室温放置1小时，加水1.25ml，作为供试品溶液4。
（2）取多糖含量20～28μg/ml的原液或成品疫苗1.0ml为供试品1。
（3）供试品溶液的矿化分别量取1.0ml供试品1、1.5ml供试品溶液2、0.7ml供试品溶液3、0.5ml供试品溶液4各2份；分别加入矿化试剂0.15ml，置150℃干燥1小时，然后升温至180℃干燥30分钟，再升温至250℃干燥1小时。
三、测定法
（1）量取水1.95ml，加矿化试剂50μl后加2.0ml产色试剂，混匀后置37℃水浴2小时，在波长825mn处测定吸光度，作为空白对照。
（2）于矿化好的供试品溶液中加水1.85ml，加产色试剂2.0ml，混匀后置37℃水浴2小时，在波长825nm处测定吸光度。
（3）分别量取磷对照品工作液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.0ml于试管中，每管依次加水1.85ml、1.75ml、1.55ml、1.15ml、0.95ml；然后每管分别加入矿化试剂50μl后加2.0ml产色试剂，混匀后置37℃水浴2小时，在波长825nm处测定吸光度。
四、结果计算
以磷对照品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回归，求得直线回归方程。将供试品溶液的吸光度代入直线回归方程，求出磷含量。
供试品磷含量（μg/ml）分别为：
P1=（A1×3）/1.0
P2=（A2×18.75）/1.5
P3=（A3×2.0）/0.7
P4=（A4×2.0）/0.5-（P3×10）/100
试验有效性80%≤P1/（P2+P3+P4）≤120%
供试品高分子结合物含量（%）=P4（P2+P3+P4）×100
供试品游离多糖含量（％）=［1-P4/（P2+P3+P4）］×100
式中P1、P2、P3、P4为供试品1，供试品溶液2，供试品溶液3，供试品溶液4的磷含量；A1、A2、A3、A4为供试品1，供试品2，供试品3，供试品4中取样矿化后的磷含量。
程诚小编结语：在不同的乙醇浓度下，高分子结合物、低分子结合物及游离多糖会沉淀并分离，这也是本法的实验原理。因为实验样品的差异性，该方法的准确性和不确定度也是尚待验证的，实际操作中大家可以多方法比较，从而确认实验结果的可靠性。
